CN Bio微流控器官芯片系统实验分享：用肝脏MPS进行寡核苷酸递送与基因敲低研究

摘要随着siRNA、ASO等寡核苷酸疗法快速发展传统动物模型在人源特异性、肝脏递送效率及基因敲低预测方面逐渐暴露局限。本文基于CN Bio PhysioMimix肝脏微生理系统MPS实验研究系统介绍器官芯片在GalNAc偶联寡核苷酸递送、原代人肝细胞摄取、基因敲低及重复给药评价中的应用并解析肝脏MPS在RNA疗法临床前研究中的应用价值。关键词器官芯片、微生理系统、肝脏MPS、PhysioMimix、寡核苷酸疗法、GalNAc偶联、siRNA、ASO、原代人肝细胞、基因敲低、药物递送、微流控器官芯片、肝脏器官芯片一、引言寡核苷酸疗法临床前测试的核心痛点随着新药物模式进入临床试验对与人体相关的体外模型的需求日益增加。传统的临床前动物模型通常无法准确预测药物的疗效和毒性导致后期药物损耗率居高不下。诸如寡核苷酸疗法等新药物模式具有高度的人体特异性需要以人体为核心的开发方法。非人物种通常不适合进行测试而更相关的选择如非人灵长类动物不仅成本高昂而且在伦理上存在挑战。因此与人体相关的新方法学例如器官芯片技术对于提高临床前测试的预测能力越来越重要。器官芯片也称为微生理系统Microphysiological System, MPS通过在灌注式3D支架上培养原代人体细胞以更具生理相关性的方式复制细胞和组织的功能性生物标志物。在初次人体试验之前MPS有潜力为评估和设计寡核苷酸疗法提供一种更具生理学意义的研究途径。基于寡核苷酸的疗法即基于RNA的疗法是干扰特定RNA分子的短序列包括反义寡核苷酸ASORNA干扰小干扰RNAsiRNAmicroRNARNA适配体等对这些疗法的兴趣源于对人类基因组的深入理解以及相较于传统小分子药物它们具备更快的药物发现速度。近年来随着脂质纳米颗粒LNP和GalNAc偶联技术的发展肝脏靶向递送能力得到了明显提升。GalNAc通过肝细胞表面的ASGPR受体实现肝脏靶向GalNAc偶联寡核苷酸与ASGPR结合肝细胞发生受体介导内吞治疗性寡核苷酸被释放最终靶向特定mRNA序列。该策略能够提高递送效率降低脱靶效应延长给药周期降低免疫原性因此GalNAc偶联疗法在遗传病、代谢疾病及感染性疾病研究中展现出重要潜力。由于寡核苷酸通过GalNAc相关内吞作用被肝细胞快速摄取因此这一策略已广泛用于肝脏疾病靶向疗法设计。本研究基于CN Bio PhysioMimix肝脏MPS系统研究GalNAc偶联siRNAGalNAc偶联ASO在原代人肝细胞中的摄取能力基因敲低效果重复给药表现长周期培养稳定性二、研究目的建立肝脏MPS寡核苷酸递送评价体系本文介绍CN Bio PhysioMimix肝脏MPS用于研究寡核苷酸向肝脏的递送及其被原代人肝细胞的摄取。该肝脏MPS能够生成功能稳定状态良好长周期培养的原代人肝细胞微组织从而支持基因敲低研究药物递送研究给药策略评价等实验。为满足RNA疗法体外评价需求本研究使用带GalNAc偶联的小干扰RNA不带GalNAc的小干扰RNAGalNAc偶联反义寡核苷酸非偶联反义寡核苷酸靶向原代人肝细胞。研究结果显示原代人肝细胞能够有效摄取寡核苷酸GalNAc偶联策略可提高基因敲低效率肝脏MPS可支持重复给药研究长周期培养下细胞保持良好功能。三、实验材料与方法肝脏MPS寡核苷酸递送与基因敲低评价体系1、PhysioMimix肝脏MPS系统实验使用PhysioMimix Core系统多芯片肝脏-12板该板包含12个培养孔。每个孔中均包含胶原蛋白涂层3D支架独立灌流系统原代人肝细胞以0.6 × 10⁶ cells / 支架密度接种。支架孔隙与微流控灌注系统结合使培养基持续流动从而提供氧气交换维持营养供应更接近体内肝脏微环境2、实验中使用的寡核苷酸siRNA体系实验使用GalNAc-siGAPDH-Cy5Naked-siGAPDH-Cy5GalNAc-siScrambled-FAM用于研究摄取能力GAPDH基因敲低ASO体系实验使用GalNAc-ALBASO-Cy5Naked-ALBASO-Cy5GalNAc-非靶向乱序ASO-FAM用于研究ALB基因敲低ASO摄取给药策略影响3、实验检测方法免疫荧光成像用于观察Cy5/FAM标记寡核苷酸摄取肝细胞分布微组织结构qPCR检测使用RNA提取cDNA反转录TaqMan qPCR分析GAPDH表达ALB表达基因表达采用ΔΔCq分析。细胞功能检测使用白蛋白ELISALDH显色法分别评价肝细胞功能细胞损伤情况四、实验结果PhysioMimix系统下寡核苷酸摄取与疗效评估结果一使用PhysioMimix生成稳定3D人肝脏微组织研究中原代人肝细胞于第0天接种每2–3天换液第4天开始给药观察周期为14天。研究发现肝脏微组织结构稳定肝细胞功能维持良好可支持长期递送研究。图1 使用PhysioMimix核心微生理系统生成3D人肝脏微组织。(A) PhysioMimix系统概览(B) 多芯片肝脏-12板结构© 微流控灌流循环(D) 14天给药时间线(E) 原代人肝细胞形成的3D肝脏微组织。结果二GalNAc偶联siRNA可增强GAPDH基因敲低实验发现GalNAc-siGAPDH组的GAPDH敲低效果更明显Naked-siRNA虽然可被摄取但功能性基因沉默能力弱于GalNAc偶联组。研究同时发现尽管Naked-siRNA荧光信号更强但并不意味着其功能性递送更优。说明“摄取量”与“有效基因沉默”并不完全一致。这可能与内吞途径亚细胞定位内涵体逃逸效率等因素有关。图2 在肝脏MPS中引入GalNAc偶联、荧光标记的小干扰RNA。结果三GalNAc-siRNA对GAPDH表现出剂量依赖性敲低研究进一步测试10 nM50 nM100 nM不同浓度siRNA。结果显示GAPDH敲低呈剂量依赖性浓度越高敲低效果越明显同时Cy5摄取信号增强。此外白蛋白水平稳定LDH维持低水平说明不同浓度下未观察明显毒性。图3 GalNAc偶联靶向小干扰RNA对GAPDH的剂量依赖性敲低。结果四ASO在肝脏MPS中实现持续摄取与ALB敲低研究在第4天进行单次给药。结果显示ASO在第14天仍可检测到摄取信号GalNAc-ALBASO对ALB基因敲低效果更明显肝细胞功能维持稳定。与siRNA实验结果一致GalNAc偶联体系在功能性基因沉默方面更具优势。图4 单次给药下反义寡核苷酸的持续摄取和有效基因靶向。结果五重复给药进一步增强基因敲低效果研究比较单次给药重复给药第4、6、8天结果显示重复给药组摄取量增加基因敲低更明显肝细胞功能稳定未观察明显毒性。说明肝脏MPS非常适合长周期递送研究多次给药研究RNA疗法评价图5 在肝脏MPS中比较GalNAc偶联反义寡核苷酸的单次和重复给药。五、讨论分析肝脏MPS在RNA疗法中的应用价值本研究证明PhysioMimix肝脏MPS可有效用于siRNA研究ASO研究GalNAc递送研究原代人肝细胞研究基因敲低研究相比传统2D培养肝脏MPS具备更真实的人源微环境动态灌流长周期培养重复给药支持更接近体内递送行为等优势。此外研究还提示GalNAc偶联并不一定提高“总摄取量”但能明显提高功能性递送效率基因沉默能力这一结果对于RNA药物设计递送系统优化肝脏靶向开发具有重要意义。六、未来方向器官芯片在RNA疗法中的潜力未来肝脏MPS仍可进一步扩展1、引入Kupffer细胞用于研究免疫毒性炎症反应巨噬细胞参与机制2、多器官联动例如肝-肾芯片肝-肠芯片用于研究药物代谢排泄分布3、新型递送体系包括LNP脂质纳米颗粒双特异性递送新型RNA载体等。七、结论本研究证明基于PhysioMimix的肝脏MPS系统能够稳定培养原代人肝细胞有效研究siRNA与ASO递送支持重复给药实现功能性基因敲低评价。研究结果显示GalNAc偶联可明显增强基因沉默肝脏MPS适用于RNA疗法临床前研究微生理系统可作为动物模型的重要补充。对于siRNAASORNA疗法肝靶向递送GalNAc偶联研究而言器官芯片与微生理系统正在成为重要的发展方向。文献参考J. Debacker et al., Mol Ther. 2020K.J. Livak T.D. Schmittgen, Methods. 2001J. Majer et al., Lab Chip. 2024T.C. Roberts et al., Nat Rev Drug Discov. 2020Rubiano et al., Clin Transl Sci. 2021本文基于CN Bio公开研究资料由其中国提供商上海曼博生物整理用于科研信息分享和相关实验应用参考。