一.样本试剂寄送要求二贴壁细胞制备Protocol1、在超净台内使用75%乙醇擦拭外包装铝箔袋2、拆开铝箔袋取出内置器皿后用尖镊将内置爬片取出放入所用培养板或培养皿内3、用胰酶消化好细胞充分吹打使之成单细胞悬液注意这一点很重要关系到将来爬出来片子的质量4、种植细胞时根据玻片的大小先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起然后放玻片防止加细胞悬液时玻片漂起造成双层细胞贴片。整个过程注意无菌操作。5、根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可。6、使用细胞爬片时比如在6孔板钟放入爬片6孔板的孔底面积往往比爬片面积多出一部分加细胞悬液时常常就是细胞铺满整个孔底有时细胞生长边集现象就是靠近壁边缘细胞密度要高一些这样处于中央细胞爬片上的细胞数量相对较少比较好的做法是将爬片放入孔内后加细胞悬液时只滴到爬片上一直滴到液体布满整个爬片但又不易溢出爬片边缘放到培养箱里等细胞贴壁后取出再滴加培养基布满整个孔底继续培养这样爬片上的细胞生长的密度就会很集中。7、细胞放到爬片上之后加任何试剂都应沿培养板板壁少量一点点倒入液体直到细胞被液体淹没尽量不要把细胞冲到细胞爬片以外8、作用一定时间后取玻片。取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧张力较大一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩这样将爬片轻轻勾起用小镊子取出就可以了。如果要做诸如24h48h72h等这样时间点的实验的话将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。末取出的可接着继续培养。9、细胞爬片有多层包装在超净台无菌状态下打开包装未用完的爬片按照原先包装方式再包装起来即可。10、爬片表面带有正电荷请勿用手触摸以免效果不佳三悬浮细胞制备Protocol取悬浮细胞液1500-3000rpm离心5min离心管底部能看到白色细胞团弃上清PBS清洗两遍离心收集清洗好的细胞弃上清加入固定液重悬室温固定15-20min。四常见细胞容器对应细胞培养量及抗体体积五细胞样本关键注意事项1、爬片消毒必须彻底75% 酒精消毒后需用 PBS 充分洗涤避免酒精残留导致细胞死亡2、固定避免使用甲醇 - 丙酮混合液固定适合膜蛋白但易使细胞皱缩但会破坏脂质和膜结构。固定剂首选4%多聚甲醛适合膜蛋白和大部分胞内蛋白但可能掩盖磷酸化表位固定后务必PBS洗3次每次5分钟彻底去除残留固定剂。3、细胞吸附多聚赖氨酸包被不充分或细胞静置时间不足会导致细胞脱落若细胞吸附效果差可延长静置时间至 45min或提高细胞浓度。4、细胞密度控制不同细胞系的生长速度和贴壁能力差异较大建议细胞在爬片上生长至 50%70%汇合度密度过高会导致细胞重叠不便于清晰观察单个细胞的形态和结构影响后续染色观察密度过低则细胞数量不足实验结果不稳定。5、对照设置设置阴性对照排除非特异性染色干扰。6、制备细胞样本的时候建议一个组别多送几个样本实验前都会观察选取细胞状态好的使用。六孔板耗材推荐1.多聚-D-赖氨酸包被细胞培养板细胞贴壁速度更快贴壁更牢2.共聚焦爬片防止运输过程中爬片移动3.腔室载玻片