脂质是一类广泛存在于生物体中的有机分子它们在细胞的结构和功能中扮演着重要角色。脂滴和胆固醇是脂质的不同形式它们在结构和功能上有所不同。脂滴是中性脂的主要贮存场所包括脂酰甘油和酯化胆固醇。在病理情况下如器官发生脂肪变性细胞内可能出现脂滴增多通过脂肪染色能将这些脂滴清晰的显现出来。胆固醇是真核细胞细胞膜的重要成分能够维持膜结构完整性调节膜流动性参与信号转导在动脉硬化、型尼曼匹克病(Niemann-Pick disease type C, NPC)、阿尔茨海默病等疾病的发生发展过程中起着重要作用。脂滴和胆固醇的染色是病理学和细胞生物学研究中的重要技术用于观察和量化细胞内脂质的积累。目前脂滴染色使用最广泛的染料包括油红O(Oil Red O)、尼罗红(Nile Red)、苏丹染料(Sudan Dyes)等。胆固醇染色使用最多的染料是菲律平(Filipin III)Filipin已被广泛应用30余年。它可用于标记生物膜结构上及非细胞结构内的自由胆固醇也能配合应用胆固醇酯化酶使胆固醇酯水解成自由胆固醇而间接显色。接下来小爱就给大家详细介绍脂滴和胆固醇的染色方法。一、脂滴染色1、组织切片脂滴油红O染色1实验原理油红O属于偶氮染料是很强的脂溶剂和染脂剂与甘油三酯结合呈小脂滴状。脂溶性染料能溶于组织和细胞中的脂类它在脂类中的溶解度比在溶剂中大。当组织切片置入染液时染料则离开染液而溶于组织内的脂质如脂滴中使组织内的脂滴呈橘红色。2染色步骤[1]① 油红O染色液配制a.母液准备称取1g油红O加入100mL异内醇配置成储存液棕色瓶4℃密封保存。b.工作液准备使用前加双蒸水稀释至60%滤纸过滤后使用。② 用冰冻切片机切取5μm厚的肝组织切片③ 用95%乙醇固定蒸馏水清洗1min60%异丙醇浸泡30min④ 再用60%油红O染色溶液处理10min和15min蒸馏水冲洗1min⑤ 苏木素复染用自来水清洗1~3min光镜下观察肝细胞脂质沉积情况。3肝组织油红O染色结果图注图片来源于文献[1]2、细胞脂滴尼罗红染色以下染色方法仅供参考1实验原理尼罗红是一种亲脂性荧光染色剂它是一类环境敏感性荧光染料能够在富含脂质的环境中产生强烈的荧光而在水性介质中的荧光强度极小这种特性使得它成为了一款极重要检测细胞内脂滴的荧光指示剂可以通过荧光显微镜和流式细胞检测结果。2染色步骤① 尼罗红染色液配制a.母液准备取适量的尼罗红Mw318.37g/mol用无水DMSO充分溶解制备1mM储存液按照单次用量分装冻存避免反复冻融避光保存。b.工作液准备用HHBS或生理缓冲液(pH 7.0)将母液按1:1000稀释为1×尼罗红工作液漩涡混匀。【注意】尼罗红的实际染色浓度请参考文献或实验室体系来调整。以上只做参考。② 用检测化合物处理细胞一段时间③ 离心并调整细胞浓度为1-5×10^5cell/管④ 用500µL尼罗红工作液重悬细胞⑤ 室温或37ºC避光孵育5-10min⑥ 吸掉染色工作液用HHBS或适当缓冲液清洗细胞⑦ 用500µL预热的HHBS或培养基重悬细胞使细胞密度为1-5×10^5cell/管⑧ 荧光显微镜或流式细胞仪检测荧光信号Ex/Em552/636nm。【注意】① 对于贴壁细胞可用HHBS或适当缓冲液清洗细胞然后直接加入尼罗红工作液孵育② 细胞也可预固定然后用尼罗红工作液染色。二、胆固醇染色细胞胆固醇菲律平(Filipin III)染色1实验原理菲律平的主要成分是Filipin III它可以特异性地与游离胆固醇相互作用而不与酯化的胆固醇结合。这种特异性结合是由于菲律平分子结构中包含多个共轭双键使其能够与胆固醇分子的疏水部分形成复合物。当Filipin III与游离胆固醇结合后其激发光谱波峰约在360nm处发射光谱波峰约在480nm处。通过检测这些特定波长附近的荧光信号可以表征细胞内的胆固醇含量。2染色步骤[2]① 菲律平染色液配制a.母液准备1mg菲律平粉末中加入1mL DMSO完全溶解配置成1mg/mL储存液按照单次用量分装冻存避免反复冻融避光保存。b.工作液准备使用前取适量母液加入到PBS中稀释成一定浓度的工作液如0.1mg/mL备用。② 将细胞接种于盖玻片中培养12-18h③ 用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次后在室温下用4%多聚甲醛固定20min④ 室温下用0.1mg/mL菲律平III处理细胞30min⑤ 细胞再用0.35μg/mL碘化丙啶(PI)染色5min⑥ 最后用共聚焦激光扫描显微镜在405nm处检测菲律平和PI染色的荧光强度。3星形胶质细胞/神经元细胞菲律平染色结果图注图片来源于文献[2]关于脂质染色小爱今天就介绍到这里~参考文献[1] Ji X, Ma Q, Wang X, et al. Digeda-4 decoction and its disassembled prescriptions improve dyslipidemia and apoptosis by regulating AMPK/SIRT1 pathway on tyloxapol-induced nonalcoholic fatty liver disease in mice[J]. J Ethnopharmacol. 2023;317:116827.[2] Huang Y, Zhang W, Guo X, et al. Cellular cholesterol loss by DHCR24 knockdown leads to Aβ production by changing APP intracellular localization[J]. J Lipid Res. 2023;64(5):100367.