外周血单个核细胞Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC是指外周血液即除骨髓以外的循环血液中具有单个细胞核的一类免疫细胞的总称。它是免疫学、传染病、肿瘤及疫苗研发等领域最基础和重要的实验原料。犬外周血单核细胞的的分离纯化方案采用经典密度梯度离心法以及提高纯度的优化方法方案。图.全血组成以及各种组分的含量对于大多数常规实验经典的密度梯度离心法Ficoll-Hypaque 是首选它通常包含以下步骤1. 核心步骤Ficoll-Hypaque 密度梯度离心目前分离PBMC最经典、最常用的方法其核心原理是利用不同细胞的密度差异进行分离。Ficoll分离液是一种密度约为 1.077 g/mL 的溶液正好介于不同血细胞的密度之间。分离过程将抗凝血小心叠加在Ficoll分离液之上。离心后红细胞和粒细胞因密度较高而沉至管底血浆和血小板因密度较低而留在上层而PBMC的密度与Ficoll液相近因此会被“拦截”在血浆与分离液的界面上形成一层白色的“白膜层”。结果通过吸取这层白膜即可获得高纯度的PBMC。该方法分离的PBMC纯度可达 95% 以上细胞活性台盼蓝染色法检测通常也高于 95%。图.Ficoll 法分离犬PMBC示意图详细分离步骤准备血液使用EDTA或肝素钠的抗凝真空采血管采集新鲜犬外周血。血液采集后应尽快处理如30分钟内以保持细胞活性和状态。稀释与铺层将血液与无菌PBS按1:1的比例混合稀释。在离心管中先加入Ficoll分离液然后将稀释后的血样小心地沿管壁缓慢叠加在其上层注意保持清晰的界面。Ficoll与稀释后血液的体积比通常为1:1。离心在室温18-22°C下进行离心关键的离心条件会因方案而异几种有效条件如下900 × g持续30分钟500 × g持续40分钟700 × g持续80分钟收集与洗涤离心后可观察到液体分为数层其中呈白膜状的PBMC层位于血浆层与Ficoll分离液之间。用移液管小心吸取该细胞层转移至新离心管。加入PBS或细胞培养基如含10% FBS的PBS洗涤细胞常用洗涤条件为 400 × g 离心10分钟通常洗涤2次。2. 提高纯度优化方案一三步法如果你的实验对细胞纯度要求极高这个方案能显著提升效果。它的关键在于增加了一个“羰基铁吞噬”的预处理步骤来高效清除中性粒细胞。第1步羰基铁预处理在稀释后的血液中加入10% (v/v) 的羰基铁粉与阿拉伯胶混合物充分混匀后在37°C下孵育30-60分钟。此步骤可让吞噬细胞主要是中性粒细胞吞噬羰基铁颗粒。第2步Ficoll密度梯度离心将上述孵育后的血液小心铺在Ficoll分离液密度1.079 g/cm³上。完成离心步骤。第3步贴壁纯化将离心后收集的PBMC重悬放入预先用纤维蛋白原包被的培养瓶中在37°C培养箱中静置孵育通常1-2小时进一步去除黏附能力强的单核细胞富集淋巴细胞。3. 细胞质量控制分离完成后务必对获得的细胞进行以下基础质量评估细胞数量使用血球计数板计数PBMC的得率会因个体差异而异。细胞活力分离后应立即检测。通常采用台盼蓝染色法活力应95% 为佳。细胞纯度通过流式细胞术或血涂片染色镜检评估确保淋巴细胞比例符合实验要求。4. 应用场景分离到的犬PBMC是进行以下研究的基础免疫功能研究用于淋巴细胞增殖实验如ConA刺激。免疫细胞分选可作为起始样本通过磁珠分选进一步纯化特定免疫细胞亚群如CD34造血干细胞、自然杀伤细胞NK细胞或CD14单核细胞。细胞治疗研究作为种子细胞用于体外扩增NK细胞等进行肿瘤免疫治疗的临床前评估。常见问题与解决方案现象获得的细胞层中红细胞污染严重。主要原因Ficoll分离液密度不匹配犬的理想密度为1.079 g/cm³左右或铺层时界面被破坏。解决方案确认Ficoll密度并重新仔细铺层。现象1血小板污染导致细胞聚团或实验背景高。主要原因血小板密度与PBMC接近常规单次Ficoll离心难以完全去除。解决方案采用“Ficoll Percoll”两步离心法即在Ficoll分离后将收集的细胞再进行一次Percoll密度梯度离心可有效去除血小板。现象2细胞得率远低于预期。主要原因离心条件不适宜如离心力过大导致细胞破裂或过小导致细胞未完全分离。解决方案优化离心参数或检查抗凝剂是否使用正确肝素抗凝常比EDTA效果更好。武汉云克隆科技股份有限公司正式推出犬外周血单核细胞PBMC原代细胞产品货号CSI165Ca01。该产品源自8-12月龄SPF级比格犬外周血经严格的密度梯度离心法分离纯化细胞纯度高、活力好不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等污染物。产品提供新鲜或冻存两种形式适配RPMI-1640专用培养基含5% FBS及生长添加物确保细胞状态稳定。云克隆深耕原代细胞领域近二十年已制定400余种原代细胞分离和培养方案涵盖犬、猫、猪、兔等10余个物种。公司持有实验动物生产、使用许可证及动物防疫条件合格证并整体通过ISO 9001与ISO 13485质量体系认证。上述犬PBMC产品可广泛应用于犬类免疫学、传染病发病机制、兽用疫苗药效评估及细胞治疗等研究场景结合公司现货蛋白、抗体及ELISA试剂盒产品线能够为全球科研用户提供从细胞到检测的全链条支持。