1 研究背景与问题提出在重组蛋白药物开发中蛋白 PEG 修饰是延长半衰期、降低免疫原性的核心技术。N - 末端定点蛋白 PEG 修饰产物均一性好、活性保留高但修饰效率受多参数耦合影响传统单因素优化无法满足工艺开发需求。本文基于 DOE 实验设计实现 rhFGF-21蛋白 PEG 修饰工艺的精准优化与放大验证。2 技术瓶颈分析多因子交互作用4 个关键参数存在显著交互单因素法无法解析响应值平衡需同时提升单修饰率、抑制多修饰与二聚体工艺稳健性需确立可放大的操作空间降低批量波动表征标准化RP-HPLC 方法需稳定可靠支持定量分析3 技术方案实现3.1 靶标与体系靶蛋白rhFGF-21修饰类型N - 末端定点蛋白 PEG 修饰修饰试剂mPEG-pALD 20KD还原剂NaBH₃CN检测方法RP-HPLCC18 柱梯度洗脱UV 检测3.2 DOE 设计模型CCF 中心复合面中心设计因子反应时间、PEG / 蛋白比、NaBH₃CN/PEG 摩尔比、蛋白浓度响应值单 PEG 修饰率、多 PEG 修饰率、二聚体比例实验量27 组含中心点重复3.3 模型分析拟合度R²0.75Q²0.5模型有效性 0.25显著因子PEG / 蛋白比、NaBH₃CN/PEG 摩尔比为核心影响因子交互效应PEG 比例与还原剂比例存在显著交互作用3.4 工艺确认最优区间蛋白浓度 6.5±0.5mg/mL时间 17±1hPEG / 蛋白 2.5±0.5NaBH₃CN/PEG120±10放大规模100g 中试5 批验证4 性能验证数据单修饰率均值 71.52%RSD1.60%多修饰率均值 8.56%RSD10.85%模型 P 值0.001拟合显著放大一致性小试→中试线性放大无明显偏移5 结论DOE 实验设计可高效解析蛋白 PEG 修饰的多因子耦合效应精准定位稳健工艺空间实现修饰率翻倍与放大稳定为蛋白药物长效化工艺开发提供可复用技术方案。关键词蛋白 PEG 修饰DOE 实验设计工艺优化rhFGF-21工艺放大RP-HPLC参考文献张玲曹小丹。采用实验设计 (DOE) 方法优化 rhFGF-21 蛋白聚乙二醇修饰工艺的研究和工艺放大验证 [J]. 药物生物技术2025,32 (04):426-432.